アミノ酸の分析

イオン交換樹脂を詰めたカラムを使って、多種類のアミノ酸混合物試料は分離します。分離にはアミノ酸、樹脂、溶離液の三つの間の化学的親和力の差を利用します。試料には、血中、尿中に含まれる遊離アミノ酸と、タンパク質を塩酸分解して得られるアミノ酸との 2 種類があり、前者は、血液と尿中に含まれるもので、生体アミノ酸といわれ、50成分以上のアミノ酸混合物から成り立っており、後者は加水分解アミノ酸といわれ、１７成分のアミノ酸混合物から成り立っています。

AminoTacによって分析された加水分解標準アミノ酸分析【分析時間 18 分】と生体標準アミノ酸分析【分析時間 60 分】のデータを示します。水溶液中ではアミノ酸はイオン状態にあるため、イオン交換クロマトグラフィーによって分離する方法がもっともよいとされています。アミノ酸は、同一分子内にカルボキシル基【 -COOH 】とアミノ基【 -NH2 】を持つ酸性、塩基性の両性物質なので、溶離液のpH、イオン強度を変化させることによってアミノ酸のイオン交換樹脂に対する選択性を簡単に変化させることが可能です。水溶液の中のアミノ酸は、＋の電荷を帯びています。

そして個々のアミノ酸によってその電荷量はまったく異なります。一方、イオン交換樹脂【直径 5 ミクロン＝ 1/200mm 程度の粒子状樹脂】は、水溶液の中ではいつも?の電荷を帯びています。カラムという円筒形の管にイオン交換樹脂を詰めて、アミノ酸の混合物である試料を上から注ぎいれ、連続的に液を流します。

そうすると、イオン交換樹脂とアミノ酸の間には、親和力の一種の静電的引力というものが作用し、溶出時間の差となって各アミノ酸の電荷の量の違いが現れ、電荷の小さいアミノ酸から順番に、カラムの下端から溶け出してきます。混合物のアミノ酸はこういった原理で分離されます。この時、カラムに流す液体を緩衝液というように呼びます。溶液中では分離したアミノ酸は無色透明なので、 100℃ 近くの反応槽でニンヒドリンという発色剤を加えて反応させると紫に発色します。

その発色は570nmに最大吸収があるので可視吸光光度計で測り、吸収曲線を A/Dに変換してデータを印字します。アミノ酸としか発色剤は反応しないため、例えアミノ酸と同時に何かが溶出したとしても、アミノ酸だけしか検出されません。アミノ酸の検出法は、すごく特異的な性格を持つ検出法だといえます。

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